식물세포배양의 실제

시료의 준비

식물세포를 대량 배양하기 위해서는 먼저 적절한 조직이나 기관으로부터 캘러스를 유도하여야 한다. 초대배양에서 얻어진 캘러스를 구성하는 세포는 대부분 형태적으로나 생장속도면에 있어서 아주 불균일하므로 생물반응기를 이용한 배양에는 부적합하다. 따라서, 균일한 급속 생장 세포주의 선발이 필요하다. 대상 식물에 따라 다소 다르지만 초대배양 후 6개월 정도 캘러스를 계대 배양할 때 생장속도가 빠르면서 대체로 흰색 또는 옅은 노란색을 띠는 세포 덩어리를 육안으로 선발할 수 있다. 이러한 세포 덩어리만 따로 분리하여 지속적으로 계대 배양할 경우 생장속도가 빠른 세포주를 선발할 수 있는데 이러한 육안 선발법은 시간이 많이 소요되고 실험자의 주관적인 판단에 따라 효율이 달리 나타나는 단점은 있지만, 대체로 효과적이라고 생각된다. 더욱 효과적인 방법은 육안으로 선발한 캘러스를 액체 현탁배양 후 단세포 또는 몇 개의 세포 응집체만 모아서 이를 고체배지에 플레이팅 한 후 단세포 유래의 급속 생장 세포를 선발하는 것이다. 육안 선발법과 단세포 배양법을 여러 차례 거친 후 선발된 세포주를 이용하여 액체 현탁배양을 확립한 다음 이를 생물반응기에 배양하는 것이 좋다. 대상 식물에 따라 현탁 배양된 세포가 뭉쳐서 지름이 1mm 이상인 덩어리로 자라는 경우에는 여러 가지 방법으로 단세포성 세포를 얻을 수 있지만, 소독한 날을 장착한 분쇄기를 이용하는 것이 가장 효율적인 방법이라고 생각되며, 일반적으로 12,000 rpm으로 10~30초 동안 마쇄하는 것이 좋지만, 대상 세포에 따라 전단응력에 대한 민감도가 다를 수 있으므로 기본적인 실험을 해보는 것이 바람직할 것으로 생각된다. 분쇄한 세포 배양체는 가는 망을 통과시켜 일정 크기의 세포를 분리시킨 후 액체 내의 침강속도를 이용하여 깨진 세포 및 세포 내용물을 제거한다. 이렇게 조제한 세포 배양체는 약 3일 동안 현탁 배양한 후 세포의 활력 및 오염을 꼭 점검하는 것이 필요하다. 단세포성 급속 생장 세포주가 선발되면 이를 이용하여 현탁배양을 확립한다. 현탁배양 중인 세포는 2주마다 계대배양을 하고, 최종 계대 배양일로부터 1주일 후에 생물배양기로 옮기는 것이 좋으며, 이때 생물반응기 내 초기 세포의 밀도는 침전 후 체적으로 20~30%가 되도록 맞추어 준다.

생물반응기의 조립

간단한 실험인 경우에는 공기 발생장치로서 수조용 기포발생기를 사용하여 소독용 미세 필터에 연결하며, 센서류는 부착하지 않아도 된다. 생물반응기의 공기주입구와 공기 배출구의 소독용 미세 필터 앞부분을 분리하여 증기 멸균소독을 준비한다.

생물반응기 및 배지의 소독

생물반응기의 멸균은 증기멸균기에 일반적인 초자기구 소독방법과 같이 실시하는데, 대체로 121℃에서 약 40분간 소독한 후 연결부위에 파손이 있는가를 확인한 다음 생물반응기 및 부대장치에 존재하는 과도한 수분을 제거하기 위하여 90℃ 정도로 유지시킨 건조기에 4시간 정도 둔다. 건조가 끝나면 이를 무균상에 넣어 두고, 필요할 때 배지 저장고 등의 부대장치를 연결시킨다. 배양 배지는 소량 조제 시 5L 규모의 삼각플라스크에 배지를 약 3L 분주한 다음 증기 멸균기로 약 40분간 소독하여 사용할 수 있지만, 조제하여야 할 배양 배지의 양이 많을 경우에는 소독용 미세 필터를 이용하는 것이 바람직하다. 배양 배지를 생물반응기에 넣어 줄 때에는 공기압에 의하여 이송되는 방식이 가장 안전하다. 생물 반응기와 배양 배지를 따로 소독하여 사용하기 때문에 각각의 단계에서 오염될 수 있는 확률이 높을 뿐만 아니라 소독한 배지를 생물반응기 내로 이송하는 과정 또는 부수적으로 연결한 이송라인에 의하여 오염될 가능성을 배제하기가 어렵다. 따라서, 세포배양 전 최소한 1주일 동안 배지만 넣은 상태에서 공배양을 한 다음 육안으로 오염성 여부를 판별하도록 하며, 가능하면 3M에서 시판되는 오염 측정키트를 이용하여 최종적으로 오염 여부를 확인하는 것이 바람직하다.

세포의 대량 배양

생물반응기에 한번 배양하여 배양세포와 그 배지를 수확하는 화분 배양의 경우에는 적정 배양 규모를 산정한 후 총 배양 규모 10~30% 내외의 세포를 접종한다. 시기적으로 일정한 양의 배지를 첨가하는 배양방법을 이용할 경우 초기에는 총 1L 규모에서 시작하고 대수 생장기 말기에 새로운 배지를 일정량 첨가해 준다. 이 방법은 수확량을 연구목적에 따라 탄력적으로 조절할 수 있으며, 초기 배양 시 소량의 세포 배양체가 필요하다는 장점을 지니고 있다. 일정량의 세포 배양체를 생물반응기 내에 유지시키면서 주기적으로 수확하는 연속배양을 실시할 경우에는 적절한 시점에 배지를 교환하고 일정한 양의 세포를 수확할 수 있는 방법을 적립하는 것이 중요하다. 연속배양의 경우에는 화학성분 평형유지법 또는 밀도 평형유지법에 따라 배양할 수 있는데, 전자의 경우 배양기간 중 배지의 화학적인 성분이 고갈되는 시점에 새로운 배지를 넣어야 하므로 일정한 시점이 지난 후에 수확하는 배양체의 양과 배양 배지가 조절 배지의 상태로 유지되도록 하는 것이 중요하다. 화학성분 평형유지법에 있어서 사용 중인 배지 내 영양분의 결핍은 여러 가지 방법에 의하여 측정할 수 있는데, 가장 단순하고도 효과적인 방법은 배양기간 중의 세포 생장곡선과 주기적으로 채취한 배양 배지의 전기전도도 및 당분석 등을 실시한 후 세포의 생장이 대수 생장기 말기에서 정체기로 넘어가는 순간의 영양분 상태 이하로 떨어지지 않도록 새로운 배양액을 첨가하는 것이다. 전기전도도의 경우 전기 전도계를 사용하여 측정하고 배양 배지에 특정 성분의 소모량은 이온 크로마토그래프, 그리고 당분석은 고성능 액체크로마토그래프를 이용하면 쉽게 분석할 수 있다.